A549-mitodsred 稳转细胞系
产品信息
Product Information
细胞基本信息
细胞名称 | A549-mitodsred 稳转细胞系【STR鉴定正确】 | |||
别称 | 无 | |||
细胞货号 | GC190404906 | |||
细胞背景 | A549细胞是由D·J·Griad通过肺癌组织移植 培养建系，源自于一位58岁白人男性；属于人类 非小细胞肺癌细胞系，是肺癌人类肺泡基底上皮 细胞，一般用于肺癌、病毒等方向的研究。 | |||
细胞形态 | 上皮细胞样 | |||
供体来源 | 男性 ；58岁 | |||
细胞类型 | 肿瘤细胞 | |||
收录 | 基恩科细胞库 | |||
培养条件 | 37℃；5% CO2；饱和湿度 | |||
培养体系 | 专用培养基（货号：SZJNK-01483-001）或90%Ham's F-12+10% FBS+1% P/S | |||
倍增时间 | 约（24-48）hours | |||
冻存条件 | 冻存液：55% 基础培养基 + 40% FBS + 5% DMSO；液氮 | |||
Puro筛选浓度 | 2μg/mL | |||
无菌检验 | 阴性（√）；阳性（ ） | |||
支原体检验 | 阴性（√）；阳性（ ） | |||
MitoDsRed介绍
MitoDsRed是一类基因编码的荧光探针，通过将红色荧光蛋白DsRed与线粒体靶向序列（MTS）融合，实现对活细胞内线粒体的特异性标记与可视化。该工具自问世以来，已成为细胞生物学研究中观察线粒体形态、动态变化及细胞器互作的核心手段之一。DsRed蛋白的荧光产生依赖于其生色团的自主催化形成过程。这一过程包括环化、氧化和脱水等步骤，在DsRed2中经过优化后，成熟时间显著缩短但仍需数小时。因此，在瞬时转染实验中，通常需要在转染后24-48小时进行成像，以允许足够的蛋白表达和成熟。慢病毒介导的MitoDsRed可以实时表达荧光。
Mito-DsRed2融合蛋白的激发峰位于558 nm，发射峰位于583 nm，流式细胞术中可用488 nm激光激发，通过FL-2通道（585 nm）检测。与GFP/EYFP（激发488 nm，发射510-530 nm）实现双色成像，无光谱重叠。
A549细胞是由D·J·Griad通过肺癌组织移植 培养建系，源自于一位58岁白人男性；属于人类 非小细胞肺癌细胞系，是肺癌人类肺泡基底上皮 细胞，一般用于肺癌、病毒等方向的研究。具体参考货号GC080200006。
基恩科生物通过慢病毒pLV-mitoDsRed-puro（货号：GC010401859）感染A549细胞，Puro(筛选浓度：2μg/mL）筛选后构建了稳定表达MitoDsRed，成功构建稳定表达MitoDsRed-A549细胞，A549-mitoDsred细胞中，红色荧光呈点状、短棒状或管状分布，与线粒体的典型形态一致。在神经元中，标记的线粒体可沿轴突和树突长距离运输，其形态随着运输和局部微环境的变化而动态改变。
A549-mitoDsred Cell Line
细胞培养方法
1.培养条件
1）完全培养基成分：专用培养基（货号：SZJNK-01483-001）或90%Ham's F-12+10% FBS+1% P/S
2）培养环境：37℃、5%CO2
3）传代比例：1:2~1:4
4）传代频次：2~3 天传代一次
5）冻存条件：冻存液：90%FBS+10%DMSO温度：液氮
2.细胞培养
2.1细胞复苏
2.1.1从液氮罐或者-80℃冰箱取出细胞冻存管，并迅速将冻存管置于37℃水浴中来回晃动，迅速解冻。为避免污染，可将冻存管置于干净的一次性PE手套内再置于水浴中。
2.1.2待冻存管中液体融化后，立即取出，并用75%酒精纱布擦拭冻存管表面。
2.1.3将冻存管置于生物安全柜中，并将冻存管中的液体转移到含有约9mL完全培养基的离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.1.4 用适量的完全培养基重悬细胞并转移到新的培养瓶中，并将细胞置于5% CO2、37℃恒温培养箱静置培养。
2.2细胞传代
2.2.1 当细胞密度达到 80%以上时，可以进行传代，传代比例 1:2~1:4，2~3 天传代一次。具体操作如下：
2.2.2 吸取并弃掉培养瓶中培养基，加入适量PBS，轻轻晃动润洗细胞，然后将PBS 吸出。
2.2.3加入约1.0 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动浸润细胞，然后放在培养箱内消化 2~3 分钟，在显微镜下观察发现细胞变圆，轻轻拍打瓶壁观察到80%细胞从壁上脱落分离时即可加入约5ml完全培养基中和胰蛋白酶。并轻轻吹打将细胞从培养瓶表面吹落使细胞分散成单细胞悬液。（此处为T75培养瓶所用体积，可根据实际情况增减用量）。
2.2.4将终止消化后的细胞悬液转移至干净的15ml离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.2.5用适量的完全培养基重悬细胞，并按照传代比例（推荐传代比例1：2~1：4）转移到新的培养瓶中，并将细胞置于5% CO2、37℃恒温培养箱静置培养。
2.3细胞冻存
细胞汇合度达到80%-90%时可进行细胞冻存操作。自制冻存液成分：90%FBS+10%DMSO，为保证冻存细胞较高活力，冻存液最好提前配制并置于4℃冰箱预冷。
细胞冻存具体操作如下：
2.3.1吸取并弃掉培养瓶中培养基，加入适量PBS洗涤一次。
2.3.2 加入约1.0 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动浸润细胞，然后放在培养箱内消化 2~3 分钟，在显微镜下观察发现细胞变圆，轻轻拍打瓶壁观察到80%细胞从壁上脱落分离时即可加入约5ml完全培养基中和胰蛋白酶。并轻轻吹打将细胞从培养瓶表面吹落使细胞分散成单细胞悬液。（此处为T75培养瓶所用体积，可根据实际情况增减用量）。
2.3.3将终止消化后的细胞悬液转移至干净的15ml离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.3.4根据细胞沉淀量加入适量提前配制好并预冷的细胞冻存液（推荐1个T75培养瓶的细胞可加入3ml冻存液），轻轻吹打使细胞分散。
2.3.5将细胞悬液转移至细胞冻存管中，1ml/管。冻存管需提前写好标签或者贴好标签。标签信息包含细胞名称，代次，冻存时间及操作人员姓名等。
2.3.6将细胞冻存管置于细胞程序降温盒中，并将盒子置于-80℃冰箱中过夜。过夜后可将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
参考文献：
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