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HEK-293 AAVS1-Attp-KI Clone Cell
attP位点（噬菌体附着位点，Phage Attachment Site）是丝氨酸整合酶系统（如φC31整合酶）中进行位点特异性重组的两个关键DNA序列之一，另一个是attB位点（细菌附着位点，Bacterial Attachment Site），attP位点由核心区和臂（p和p')组成，核心区位于序列中央，是重组发生的确切位置，两条DNA链在此处进行交换，attP和attB位点共享一个短的核心序列（约18个碱基对），这是它们相互识别的基础。核心区的两侧是被称为“臂”的序列，它们含有不完美的反向重复序列，是整合酶蛋白结合并启动重组的关键结构。
AAVS1位点（腺相关病毒整合位点1，Adeno-Associated Virus Integration Site 1）是人类基因组中的“安全港”基因座，常被用作外源基因的稳定“停靠点”，它位于人类第19号染色体（位置19q13.42）的PPP1R12C基因内含子内部。研究表明，即使外源基因插入破坏了PPP1R12C基因位点，也不会对细胞造成已知的不良影响，因此被认为是一个安全的插入位点。这显著降低了随机基因整合带来的潜在风险，如原癌基因激活或抑癌基因失活。
通过CRISPR/Cas9 基因敲入技术在基因组特定位置插入attp位点，建立一个“停靠港“，随后，只要将带有attB位点和目的基因的载体导入细胞，在φC31整合酶的作用下，目的基因就能精确、高效地整合到预先设好的attP位点上，实现定点敲入的稳定表达，尤其在长片段基因敲入实验中有很大的优势。
（Bxb1 attp序列：ggtttgtctggtcaaccaccgcggtctcagtggtgtacggtacaaacc）
HEK-293 AAVS1-Attp-KI 细胞系验证-Sanger测序结果
测序结果与野生型细胞进行比对，证明成功在基因安全港AAVS1序列中插入attp序列，且无套峰/杂峰，证明为纯合敲入单克隆细胞株，以下为基因型比对结果。
附录：HEK-293 AAVS1-Attp-KI Clone Cell细胞培养方法
1.培养条件
1）完全培养基成分：DMEM+10%FBS+1%P/S
2）培养环境：37℃、5%CO2
3）传代比例：1:2~1:4
4）传代频次：2~3 天传代一次
5）冻存条件：冻存液：90%FBS+10%DMSO温度：液氮
2.细胞培养
2.1细胞复苏
2.1.1从液氮罐或者-80℃冰箱取出细胞冻存管，并迅速将冻存管置于37℃水浴中来回晃动，迅速解冻。为避免污染，可将冻存管置于干净的一次性PE手套内再置于水浴中。
2.1.2待冻存管中液体融化后，立即取出，并用75%酒精纱布擦拭冻存管表面。
2.1.3将冻存管置于生物安全柜中，并将冻存管中的液体转移到含有约9mL完全培养基的离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.1.4 用适量的完全培养基重悬细胞并转移到新的培养瓶中，并将细胞置于5% CO2、37℃恒温培养箱静置培养。
2.2细胞传代
2.2.1 当细胞密度达到 80%以上时，可以进行传代，传代比例 1:2~1:4，2~3 天传代一次。具体操作如下：
2.2.2 吸取并弃掉培养瓶中培养基，加入适量PBS，轻轻晃动润洗细胞，然后将PBS 吸出。
2.2.3加入约1.0 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动浸润细胞，然后放在培养箱内消化 2~3 分钟，在显微镜下观察发现细胞变圆，轻轻拍打瓶壁观察到80%细胞从壁上脱落分离时即可加入约5ml完全培养基中和胰蛋白酶。并轻轻吹打将细胞从培养瓶表面吹落使细胞分散成单细胞悬液。（此处为T75培养瓶所用体积，可根据实际情况增减用量）。
2.2.4将终止消化后的细胞悬液转移至干净的15ml离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.2.5用适量的完全培养基重悬细胞，并按照传代比例（推荐传代比例1：2~1：4）转移到新的培养瓶中，并将细胞置于5% CO2、37℃恒温培养箱静置培养。
2.3细胞冻存
细胞汇合度达到80%-90%时可进行细胞冻存操作。自制冻存液成分：90%FBS+10%DMSO，为保证冻存细胞较高活力，冻存液最好提前配制并置于4℃冰箱预冷。
细胞冻存具体操作如下：
2.3.1吸取并弃掉培养瓶中培养基，加入适量PBS洗涤一次。
2.3.2 加入约1.0 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动浸润细胞，然后放在培养箱内消化 2~3 分钟，在显微镜下观察发现细胞变圆，轻轻拍打瓶壁观察到80%细胞从壁上脱落分离时即可加入约5ml完全培养基中和胰蛋白酶。并轻轻吹打将细胞从培养瓶表面吹落使细胞分散成单细胞悬液。（此处为T75培养瓶所用体积，可根据实际情况增减用量）。
2.3.3将终止消化后的细胞悬液转移至干净的15ml离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.3.4根据细胞沉淀量加入适量提前配制好并预冷的细胞冻存液（推荐1个T75培养瓶的细胞可加入3ml冻存液），轻轻吹打使细胞分散。
2.3.5将细胞悬液转移至细胞冻存管中，1ml/管。冻存管需提前写好标签或者贴好标签。标签信息包含细胞名称，代次，冻存时间及操作人员姓名等。
2.3.6将细胞冻存管置于细胞程序降温盒中，并将盒子置于-80℃冰箱中过夜。过夜后可将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
参考文献：
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