HEK-293 Cav3.1 Cell Line
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CaV3.1离子通道介绍:
CaV3.1是T型钙通道的三种亚型之一（另外两种为CaV3.2和CaV3.3），由CACNA1G基因编码，是一种低电压激活（LVA）的钙离子通道，它可以在细胞膜接近静息电位时被激活，是神经元重要的“钙内流”来源之一。CaV3.1最核心的生理功能与神经元的兴奋性调控相关，主要作用为帮助神经元产生节律性的放电，在抑制性信号结束后，让神经元产生一次强烈的爆发式放电，这在丘脑等脑区至关重要，另外，在浦肯野细胞的树突棘中，CaV3.1在突触传递引发的局部钙信号中起主导作用。CaV3.1在体内多个组织中有表达，包括一些肿瘤组织（如肉瘤、结直肠癌等）。
1.2 HEK-293 Cav3.1检测模型
基恩科生物设计了稳定表达了人源Cav3.1钙通道的HEK-293细胞系。将人源Cav3.1基因cDNA克隆转染HEK293细胞中，单克隆筛选稳定表达Cav3.1基因，随后通过膜片钳技术验证了Cav3.1通道的功能特征。
Genecarer公司的HEK-293 Cav3.1细胞系适用于相关研究，全自动自动膜片钳（Nanion：Port-a-Patch）进行了验证。
2. HEK-293 CaV3.1细胞的验证
2.1 细胞前处理方法
细胞培养于6孔板，吸出培养基，用PBS清洗2遍，加入0.5mL胰蛋白酶（Gibco，TrypLE），37°C消化3-5min，消化完成后，每孔加入0.5mL完全培养基和0.5mL细胞电极外液，4°C放置20min，用巴氏吸管吹打10次左右吸出，进行膜片钳检测实验
2.2 采用全自动膜片钳记录HEK293 Cav3.1模型细胞电流
细胞电极外液成分如下（单位mM）：130 mM NaCl、4 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM CaCl₂、5 mM D-葡萄糖单水合物、10 mM Hepes（用氢氧化钠调节至pH 7.4）、渗透压：302 mOsmol。
电极电极内液成分如下（单位mM）：10 mM CsCl、10 mM NaCl、110 mM Cs-Fluoride、10 mM EGTA、10 mM Hepes（用氢氧化铯调节至pH 7.2）、用CsOH将pH调节至7.20，渗透压：285 mOsmol。
采用2至3.5MΩ的电极电阻进行封接。在记录电极与稳定表达Cav3.1的单个HEK-293细胞之间形成GΩ级高阻封接后，通过破膜使电极尖端与细胞内部建立电学通路，形成稳定封接，通过将细胞膜从维持电位-80 mV去极化至+50 mV（步阶增量10 mV，时程1000 ms）来记录内向钙电流。这些脉冲之后紧跟一个至+10 mV（300 ms）的脉冲，以记录尾电流幅度。电压脉冲的施加间隔为10 s。
2.3 药理学验证
米贝地尔 (Mibefradil)为经典的T型钙通道阻滞剂，可同时阻断L型和T型离子通道。采用HEK293 Cav3.1细胞，通过钙通道阻断剂的作用，灌流递增浓度的受试物，Mibefradil浓度分别为 5 nM, 50 nM, 500 nM and 5000 nM。绘制累积浓度-效应曲线并测定IC₅₀值。两次电压脉冲之间，将细胞钳制于-80 mV。在经历一个-50 mV（100 ms）的前置脉冲后，将细胞钳制于0 mV（200 ms）以开放CaV3.1通道。分析峰电流幅度的时间进程，将其归一化至对照条件下的电流幅度，并计算各测试浓度的效应。
HEK-293 Cav3.1 细胞培养方法
1.培养条件
1）完全培养基成分：DMEM+10%FBS+1%P/S
2）培养环境：37℃、5%CO2
3）传代比例：1:2~1:4
4）传代频次：2~3 天传代一次
5）冻存条件：冻存液：90%FBS+10%DMSO温度：液氮
2.细胞培养
2.1细胞复苏
2.1.1从液氮罐或者-80℃冰箱取出细胞冻存管，并迅速将冻存管置于37℃水浴中来回晃动，迅速解冻。为避免污染，可将冻存管置于干净的一次性PE手套内再置于水浴中。
2.1.2待冻存管中液体融化后，立即取出，并用75%酒精纱布擦拭冻存管表面。
2.1.3将冻存管置于生物安全柜中，并将冻存管中的液体转移到含有约9mL完全培养基的离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.1.4 用适量的完全培养基重悬细胞并转移到新的培养瓶中，并将细胞置于5% CO2、37℃恒温培养箱静置培养。
2.2细胞传代
2.2.1 当细胞密度达到 80%以上时，可以进行传代，传代比例 1:2~1:4，2~3 天传代一次。具体操作如下：
2.2.2 吸取并弃掉培养瓶中培养基，加入适量PBS，轻轻晃动润洗细胞，然后将PBS 吸出。
2.2.3加入约1.0 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动浸润细胞，然后放在培养箱内消化 2~3 分钟，在显微镜下观察发现细胞变圆，轻轻拍打瓶壁观察到80%细胞从壁上脱落分离时即可加入约5ml完全培养基中和胰蛋白酶。并轻轻吹打将细胞从培养瓶表面吹落使细胞分散成单细胞悬液。（此处为T75培养瓶所用体积，可根据实际情况增减用量）。
2.2.4将终止消化后的细胞悬液转移至干净的15ml离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.2.5用适量的完全培养基重悬细胞，并按照传代比例（推荐传代比例1：2~1：4）转移到新的培养瓶中，并将细胞置于5% CO2、37℃恒温培养箱静置培养。
2.3细胞冻存
细胞汇合度达到80%-90%时可进行细胞冻存操作。自制冻存液成分：90%FBS+10%DMSO，为保证冻存细胞较高活力，冻存液最好提前配制并置于4℃冰箱预冷。
细胞冻存具体操作如下：
2.3.1吸取并弃掉培养瓶中培养基，加入适量PBS洗涤一次。
2.3.2 加入约1.0 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动浸润细胞，然后放在培养箱内消化 2~3 分钟，在显微镜下观察发现细胞变圆，轻轻拍打瓶壁观察到80%细胞从壁上脱落分离时即可加入约5ml完全培养基中和胰蛋白酶。并轻轻吹打将细胞从培养瓶表面吹落使细胞分散成单细胞悬液。（此处为T75培养瓶所用体积，可根据实际情况增减用量）。
2.3.3将终止消化后的细胞悬液转移至干净的15ml离心管中，300g，5min离心，弃上清。
2.3.4根据细胞沉淀量加入适量提前配制好并预冷的细胞冻存液（推荐1个T75培养瓶的细胞可加入3ml冻存液），轻轻吹打使细胞分散。
2.3.5将细胞悬液转移至细胞冻存管中，1ml/管。冻存管需提前写好标签或者贴好标签。标签信息包含细胞名称，代次，冻存时间及操作人员姓名等。
2.3.6将细胞冻存管置于细胞程序降温盒中，并将盒子置于-80℃冰箱中过夜。过夜后可将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
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