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HEK-293 Cav3.1 Cell Line
CaV3.1是T型钙通道的三种亚型之一（另外两种为CaV3.2和CaV3.3），由CACNA1G基因编码，是一种低电压激活（LVA）的钙离子通道，它可以在细胞膜接近静息电位时被激活，是神经元重要的“钙内流”来源之一。CaV3.1最核心的生理功能与神经元的兴奋性调控相关，主要作用为帮助神经元产生节律性的放电，在抑制性信号结束后，让神经元产生一次强烈的爆发式放电，这在丘脑等脑区至关重要，另外，在浦肯野细胞的树突棘中，CaV3.1在突触传递引发的局部钙信号中起主导作用。CaV3.1在体内多个组织中有表达，包括一些肿瘤组织（如肉瘤、结直肠癌等）。
基恩科生物设计了稳定表达了人源Cav3.1钙通道的HEK-293细胞系。将人源Cav3.1基因cDNA克隆转染HEK293细胞中，单克隆筛选稳定表达Cav3.1基因，随后通过膜片钳技术验证了Cav3.1通道的功能特征。
一、细胞前处理方法
细胞培养于6孔板，吸出培养基，用PBS清洗2遍，加入0.5mL胰蛋白酶（Gibco，TrypLE），37°C消化3-5min，消化完成后，每孔加入0.5mL完全培养基和0.5mL细胞电极外液，4°C放置20min，用巴氏吸管吹打10次左右吸出，进行膜片钳检测实验
二、采用全自动膜片钳记录HEK293 Cav3.1模型细胞电流
细胞电极外液成分如下（单位mM）：130 mM NaCl、4 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM CaCl₂、5 mM D-葡萄糖单水合物、10 mM Hepes（用氢氧化钠调节至pH 7.4）、渗透压：302 mOsmol。
电极电极内液成分如下（单位mM）：10 mM CsCl、10 mM NaCl、110 mM Cs-Fluoride、10 mM EGTA、10 mM Hepes（用氢氧化铯调节至pH 7.2）、用CsOH将pH调节至7.20，渗透压：285 mOsmol。
采用2至3.5MΩ的电极电阻进行封接。在记录电极与稳定表达Cav3.1的单个HEK-293细胞之间形成GΩ级高阻封接后，通过破膜使电极尖端与细胞内部建立电学通路，形成稳定封接，通过将细胞膜从维持电位-80 mV去极化至+50 mV（步阶增量10 mV，时程1000 ms）来记录内向钙电流。这些脉冲之后紧跟一个至+10 mV（300 ms）的脉冲，以记录尾电流幅度。电压脉冲的施加间隔为10 s。
三、药理学验证
米贝地尔 (Mibefradil)为经典的T型钙通道阻滞剂，可同时阻断L型和T型离子通道。采用HEK293 Cav3.1细胞，通过钙通道阻断剂的作用，灌流递增浓度的受试物，Mibefradil浓度分别为 5 nM, 50 nM, 500 nM and 5000 nM。绘制累积浓度-效应曲线并测定IC₅₀值。两次电压脉冲之间，将细胞钳制于-80 mV。在经历一个-50 mV（100 ms）的前置脉冲后，将细胞钳制于0 mV（200 ms）以开放CaV3.1通道。分析峰电流幅度的时间进程，将其归一化至对照条件下的电流幅度，并计算各测试浓度的效应。
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